转载自: RPKM简介 | Zyb Blog

RNA-seq是透过次世代定序的技术来侦测基因表现量的方法，在衡量基因表现量时，若是单纯以map到的read数来计算基因的表现量，在统计上是一件相当不合理事，因为在随机抽样的情况下，序列较长的基因被抽到的机率本来就会比序列短的基因较高，如此一来，序列长的基因永远会被认为表现量较高，而错估基因真正的表现量，所以Ali Mortazavi等人在2008年提出以RPKM在估计基因的表现量。

RPKM是将map到基因的read数除以map到genome的所有read数(以million为单位)与RNA的长度(以KB为单位)。其公式为:
RPKM = total exon reads / (mapped reads (millions) * exon length(KB))
其中，total exon reads / mapped reads (millions) 可以视为所有read数中有百分之多少是map到这个基因，然后再除以基因长度，就可以某基因得到单位长度有百分之多少的total mapped read有表现。

以下就用一个简化的例子来说明RPKM的运用方式与概念:
假设一基因体只有两个基因，一个9 KB，一个1 KB，如今有一sample，其map 到9 KB的read有18 million个，map到1 KB的有2 million个。

对于9 KB 的基因而言，
Total exon reads=18 million
Mapped reads=18+2=20 million
Exon length=9 KB
RPKM =18/(20*9)=0.1

对于1 KB 的基因而言，
Total exon reads=2 million
Mapped reads=18+2=20 million
Exon length=1 KB
RPKM =2/(20*1)=0.1

由此我们可以知道这两个基因表现量没有差别。

假设此时我们有另一个sample，其map到9 KB的read有9 million个，map到1 KB的有1 million个。我们可以发现此sample中9 KB基因的read数明显比上一个sample少，如果我们计算RPKM可以得到RPKM = 9/((9+1)*9)=0.1，却与上一个sample相同，这可能是因为cDNA浓度较低或是其他sample备制过程的问题，造成整体read变少，但是对9 KB基因而言，其read数占所有read数的比例并没有发生改变，所以其表现量会和上一个sample相同。